外源基因瞬时转化烟草叶片的研究

外源基因瞬时转化是当前植物分子生物学研究的热点之一,也是植物分子育种的基础之一。烟草是外源基因瞬时转化的模式植物,其研究以及通过转基因手段获得变异植株,为外源基因瞬时转化的基础研究奠定基础。本试验选取的烟草,以根癌农杆菌EHA105菌株为介导,来

  引言

  基因工程研究的蓬勃发展,为实现植物品种的改良提供的方便。为了实现了烟草野生种、远缘种内、以及其他物种的优良基因向烟草栽培种的转移,为烟草实现现有品种的改良、新品种的培育,以及保健型、疗效型、药用型烟草的创新提供了崭新途径。烟草行业作为暴利、暴税的行业,他的发展自然引人关注,目前市面上存在许多的烟草品种改良实验。所以烟草可以说是作为基因工程研究的模式植物,虽已目前市面上已经形成了比较完善的转化体系,但是目前还有很多有利于烟草种植、生产、销售的外源转入基因尚未被发现。在大多数只把烟草作为模式植物的研究中,自然可以忽略外源基因这个外来因素,但针对烟草进行品种改良的研究,该因素就显得至关重要。根据上述情况,我们对烟草叶片的外源基因插入种类进行了研究,旨在建立一个简单、快捷、高效、稳定的烟草叶片外源插入基因,这为烟草基因工程的研究发展提供了便利。

  1材料与方法

  1.1实验材料

  Kan、Str、Rif,pBR002-VP7穿刺菌,RNA提取试剂,cDNA反转录试剂盒,无RNA酶的枪头、EP管、PCR管、DEPC水以及引物。
  烟草是经过实验室以一定的温度以及湿度和时间周期培育而成,在西北师范大学生命科学学院实验楼常规培育。农杆菌为实验室自行培养而保存的菌株,所含基因片段的转化载体均由实验室保存,实验用的酶和化学试剂均为分析纯。
  试剂的配置:
  Kan储存液(50 mg/mL)、Str储存液(100 mg/mL)、Rif储存液(25 mg/mL)的配制,Cef储存液工作时的浓度为500g/mL。
  BA:浓度为1 mg/5mL。
  NAA:浓度为1 mg/5mL。
  基本培养基(MS0):MS固体粉末4.74g/L、蔗糖30g/L,用NaOH调至pH 6.0后,加入琼脂7 g/L。121℃高压灭菌25 min。
  共培养基:在MS0培养基的基础上添加1.0 mg/L 6-BA和0.2mg/L NAA,调至pH 6.0后,加入琼脂7g/L。121℃高压灭菌25 min。
  外植体农杆菌侵染培养基:MS固体粉末4.74g/L、蔗糖30g/L,调至pH 6.0。121℃高压灭菌25min。
  外植体筛选培养基:在MS0培养基的基础上添加1.0mg/L 6-BA和0.2 mg/L NAA,调至pH 6.0后,加入琼脂7g/L。121℃高压灭菌25 min。温度降至可用手触摸时便可加入Kan,终浓度为20 mg/L。
  外植体筛选生根培养基:在MS0培养基的基础上添加0.1 mg/L NAA,pH 6.0,之后加入琼脂7g/L,121℃高压灭菌25 min。待温度降至50℃以下时加入Kan至浓度为20 mg/L。
  2XCTAB提取缓冲液(100 mL):0.5 mol/LEDTA(pH8.0)4mL,CTAB2g,2.5 mol/LNaCI 56 mL,1mol/L Tris-HC1(pH8.0)10 mL,加双蒸水定容至100 mL。过滤后常温贮存,使用前加入0.2%-巯基乙醇。

  1.2实验方法

  1.2.1农杆菌的活化

  将上海生工公司合成的pBR002-VP7穿刺菌保存于-20℃冰箱。用接种针蘸取一环菌液,三区划线接种于含有Amp的LB固体培养基上,37℃培养箱中倒置12-16h。用枪头挑几个经平板活化的单菌落接种于4mL含Amp的LB液体培养基中摇床37℃、180rpm过夜培养。
  同理将PBI121的保存菌株划线接种于含有Kan的LB平板上,37℃培养箱中倒置12-16h。次日挑取几个活化的单菌落于4mL含Kan浓度50μg/mL的LB液体培养基中摇床37℃、180rmp过夜。

  1.2.2烟草的遗传转化

  (1)农杆菌悬液的准备
  ①从农杆菌平板上挑取含有质粒1121–7的单菌落,接种于SmL含Rif和Kan的LB液体中并置于28℃、200 rpm摇床培养。
  ②次日,按照1:50的比例将1mL菌波加入50mL含有Rif和Kan的LB液体中,28C、200 rpm摇床培养4-5 h,0D600约为0.5-0.6,即可转化烟草。
  ③常温,4000rpm、10min左右离心收集菌体,并用枪头吸取烟草重悬液,调节0D600最终为0.8-1,室温放置2-3h用以侵染烟草。
  (2)注射法侵染烟草
  将长至五、六叶期的本氏烟草幼苗用去掉针头的注射器进行侵染。事先需要用一次性针头在叶片的远轴面制造伤痕以便于通过挤压活塞使农杆菌菌液缓慢进入伤口最终浸渍到叶片中。侵染后,将烟草置于黑暗条件下培养1d时长,而后正常光照培养。取侵染后5d的烟草叶片以及同阶段未被侵染的烟草叶片进行后续试验。

  1.2.3烟草植株的种植

  (1)将60粒泥炭颗粒放入繁殖盘中。
  (2)加入4L自来水,让泥炭颗粒吸水2h。
  (3)向每个泥炭颗粒中加入2个本氏烟草种子,用透明塑料圆顶盖住托盘,让它们在25℃、84湿度环境中以16/8h的昼夜周期发芽。
  (4)播种两周后取出圆顶,从托盘中排干水,加入2L Jack-s肥料,浓度为1.48g/L,继续在25℃、50湿度的环境中种植烟草,每天16/8h的昼夜周期。每个托盘没2天供应2L Jack-s肥料。
  (5)在第四周,将带有泥炭颗粒的烟草株转移到一个新的托盘上,托盘上容纳6株烟草植株,为进一步生长提供足够的空间,直到它们在6周龄时准备好渗入根癌农杆菌制剂。

  1.2.4外源基因瞬时转化烟草植株的PCR检测

  (1)烟草叶片的采集
  分别采取转化后植株和对照植株的叶片,并对其标号,保存于实验室备用。
  (2)烟草基因组总DNA的提取
  由于烟草叶片含较多酚类物质,在提取烟草基因组总DNA时,我们要对CTAB法进行了定的调整和优化。优化后的提取方法如下:
  ①取0.4-0.6g的备用叶片,将其研磨成细粉末,转入1.5 ml离心管中,加入1ml CTAB(含2%PVP),65℃水浴1h,其间轻轻混匀。
  ②向离心管中加入300林15 M醋酸钾,静置30 min。
  ③4℃10000 r/min离心15 min。
  ④将上清液转移至全新1.5 ml离心管,加异戊醇:2/3体积氯仿(1:24)轻轻摇晃15 min,充分混匀,室温下10000 r/min离心10 min。
  ⑤继续将上清液转移至新的1.5 ml离心管中,加入异戊醇,轻轻晃动离心管混匀,室温静置30 min。
  ⑥室温10000 r/min离心15 min,弃上清。
  ⑦70%乙醇洗涤沉淀3次,37℃烘干。
  ⑧将沉淀溶于50ddH2O中备用。
  ⑨琼脂糖凝胶电泳。
  (3)PCR检测
  以转化的烟草植株和野生型植株的基因组DNA为模板进行PCR扩增,通过琼脂糖凝胶电泳分析。PCR扩增反应总体积:20,其反应体系为:
  扩增循环参数为:
  ①94℃预变性3 min
  ②94℃变性30 s
  ③59℃退火45 min
  ④72℃延伸1 min
  ⑤25℃保存。
  ②一④程序进行35个循环。

  1.2.5外源基因瞬时转化烟草植株的抗生素筛选

  (1)外源基因瞬时转化的烟草外植体筛选
  ①采摘若干长势良好的叶片作为外植体。
  ②将外植体用水冲洗约20 min,置于在超净工作台中的广口瓶内,75%酒精消毒30 s,蒸馏水冲洗3-5次。0.1%升汞消毒8-10 min,消毒后再蒸馏水冲洗3-5次。
  ③至于灭菌的滤纸上,切成0.8 cmx0.8 cm的小块,接种于含MS+2.25 mg/LBA+0.3 mg/L NAA+100 mg/L KM的培养基上,一个月后观察分化情况。

  1.3烟草离体再生体系的建立

  1.3.1植物材料烟草无菌苗的获得

  将备好的烟草种子在超净工作台中用75%的酒精消毒30 s,之后用蒸馏水冲洗3~4次;再用升汞灭菌8min,然后用无菌水冲洗5~6次,无菌滤纸吸干后接种于培养基上,每天16 h/8 h光/暗处理,温度252℃,光照强度为30~50 mol·m-2·s-1萌发无菌苗,待无菌苗长到3cm左右时,将其转接到新鲜培养基上。

  1.3.2激素的不同组合对不定芽的形成的影响

  将已去除叶脉和叶柄的四周苗龄叶片以0.5cm*0.5cm切块接种于不同浓度的芽分化培养基,进行诱导40d后统计不定芽发生率,选择分化最佳的不定芽培养基。处理接种50个外植体,重复3次。

  1.3.3不同激素组合诱导生根及移栽

  将生长状态良好的幼芽(约1~2 cm长),用镊子小心地切取后,接种在不同NAA生长激素浓度(0、0.1,、0.2、0.5,1.0 mg/L)的MS培养基上,于252℃、光照强度为30~50 mol·m-2·s-1的培养室内16 h/8 h光/暗培养,20 d后通过统计不定根发生率而筛选出最适NAA激素浓度的培养基。每处理接种50个外植体,重复3次。
  待根长到3 cm左右时,打开培养瓶,3~4 d后用蒸馏水洗净外植体根部的培养基并转移到土壤中,尽量使根部伸展开,小心地覆盖土、浇水保湿。

  1.4外源基因瞬时转化烟草叶片Kan的敏感性确定

  为了确定烟草转基因植株有效的Kan的筛选浓度,取4周苗龄的无菌烟草叶片外植体(0.5 cm*0.5 cm),不经根癌农杆菌介导的含不同质量浓度的Kan的不定芽分化培养基每12d转接一次,六周后统计Kan抗性的不定芽分化率,确定Kan能够对烟草叶片产生有效的影响。每处理接种50个外植体,重复3次。

  1.5外源基因瞬时转化的烟草再生植株的获得

  常规叶圆盘法遗传转化烟草外植体,诱导抗性小芽,筛选培养,期间及时淘汰白化及死亡的非转化芽体和培养物;将正常生长分化的不定芽长到约2 cm后转移到筛选生根培养基上进行培养;待根长至约3cm时,对其进行编号并继续在含Kan的培养基上选择培养,扩增繁殖;待转基因幼苗长出较长的根系、苗高6-8 cm时,揭掉培养瓶的封口膜,让烟草幼苗适应组织培养间的环境,炼苗3-4 d;然后洗去根部的培养基并移栽到花卉营养土:沙:黄土=1:1:1的混合土中,25±2℃温室培养。

  2结果与分析

外源基因瞬时转化烟草叶片的研究

  2.1转基因烟草植株的PCR检测

  图2.1部分转基因烟草植株的PCR扩增

  注:A:转C片段的烟草抗性植株的PCR扩增:B:转MA片段的烟草抗性植株的PCR扩增;M:2000bp Marker;P:质粒DNA(阳性对照);N:未转化植株DNA(阴性对照):H:ddH2O(阴性对照);Lanel-10:转基因植株
  以野生型植株的DNA为阴性对照,质粒DNA为阳性对照,利用35S和特异引物,分别对已转化的烟草进行PCR检测。经琼脂糖凝胶电泳分析,转C和MA片段的植株都能扩增出特异条带。

  2.2转基因烟草种子和外植体筛选

  如图(2)所示,在补充100毫克/L KM的培养基上,野性烟草逐渐变黄、失去绿色,正常地分化,不能萌发幼苗,种子可以生长。两个子叶和很短的根系慢慢变黄并死亡(图b)。变成C小叶的烟草可以正常地分化和生长,而耐药性芽的生长状态正常。
外源基因瞬时转化烟草叶片的研究

  图2.2基因烟草叶片和种子的抗生素筛选

  注:A:野生型烟草叶片;B:野生烈烟草种子;C:转C段烟草种子;D:转C片段烟草种子;E:转MA片段烟草叶片;F:转MA片段烟草种子

  2.3烟草离体再生体系的建立

  在MS0培养基上烟草种子萌发无菌苗(图2.4A),植物激素浓度组合诱导无菌叶片可以产生不定芽(表2.1),但是不同组合的激素浓度对烟草不定芽发生效果不同。1.0mg/L6-BA或者2.0 mg/L 6-BA与0.2 mg/L NAA的诱导率均为100%,但是随着细胞分裂素与生长素浓度比例的增高,不定芽会发生畸变;0.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/LNAA组合培养的诱导率为46%。最终选定细胞分裂素/生长素=5,附加1.0 mg/L6-BA和0.2mg/LNAA的MS培养基作为受体叶片诱导不定芽分化的最佳培养基。
外源基因瞬时转化烟草叶片的研究

  图2.4不同质量浓度的卡那霉素对外植体叶片的影响

  A:烟草无菌苗;B-E:Kan浓度依次为5,10,15,20 mg/L

  表2.1不同浓度的生长激素对烟草叶片不定芽分化的影响

  
6-BA/NAA(mg/L) 外植体数(个) 不定芽的分化率(%) 不定芽的生长情况
0/0 50 0.00外源基因瞬时转化烟草叶片的研究0.00a ——
0.5/0.5 50 46.00外源基因瞬时转化烟草叶片的研究2.00b 正常
1.0/0.2 50 100外源基因瞬时转化烟草叶片的研究0.00c 正常
2.0/0.2 50 100外源基因瞬时转化烟草叶片的研究0.00c 部分畸形
 
  注:数值为平均值士标准差,每个处理三个重复,相同的字母用LSD分析无显著差异(P<0.05)待能够诱导出的正常的不定芽长到1~2 cm时,切取基部的幼芽,将其移入附加不同浓度NAA的MS培养基上生根,20 d后统计生根率(生根株数/接种株数X 100%)及生根状况(表2)。不定芽在所有的培养基中均能生根且生根率达100%,只是不同NAA浓度对烟草生根的效果不同。在0.1 mg/LNAA的培养基中生根长势最好,幼苗更健康生根较快,表现为径干较粗,植株较高,不定根数量较多。但是随着NAA浓度的增大,根的长势会慢慢得到抑制,生长状态也会出现部分畸形,并不是NAA的浓度越大越好。

  表2.2不同浓度的NAA对烟草不定芽生根的影响

  
NAA(mg/L) 生根率(%) 根的生长速度 根的生长情况
0 100 稍快 ++++
0.1 100 +++++
0.2 100 稍快 ++++
0.5 100 稍慢 +++
1.0 100 ++

  2.4受体植物叶片Kan敏感性的确定

  根据载体pRI101-AN上的植物筛选标记NPT II基因,在含不同浓度Kan的培养基上诱导抗性不定芽,确定遗传转化的筛选压。本实验中,叶片受到Kan毒害,使叶片在形态上就与正常分化的外植体有明显差别,结果(表2.3;图2.4B-E)显示,叶片外植体对Kan的敏感,在Kan浓度≤5 mg/L时,叶片呈现绿色并且不定芽的发生率为100%;随着Kan浓度的升高,不定芽的发生率逐渐降低,当5 mg/L<Kan≤20 mg/L浓度,不定芽的发生率从100%下降到。外植体生长状态变化明显;Kan 10 mg/L时叶片边缘呈现黄色,不定芽的发生率也降至63.3%,Kan浓度增大至15 mg/L时,叶片边缘部分出现白色,仅有少量叶片能够诱导出不定芽,Kan 20 mg/L时,叶片整体呈现黄白色,没有发芽迹象。烟草叶片对Kan敏感,在20 mg/L Kan浓度下既能能避免Kan浓度过高对外植体的再生造成伤害,又能有效的抑制大部分非转化芽的再生,用于烟草遗传转化中有效淘汰非转化植株,故烟草叶片Kan的筛选浓度20mg/L。

  表2.3不同质量浓度的Kan对外植体叶片不定芽诱导的影响

卡那霉素的浓度(mg/L) 外植体数(个) 叶片颜色 抗性出芽率(%)
0 60 绿色 100±0.00d
5 60 绿色 100±0.00d
10 60 浅绿色 63.3±4.41c
15 60 黄绿色 26.7±2.89b
20 60 黄白色 0±0.00a
30 60 黄白色 0±0.00a
50 60 黄白色 0±0.00a
80 60 黄白色 0±0.00a
100 60 多白化 0±0.00a

  3.1选择合适的外植体对转化的影响

  植物不同部位的敏感性是不同的探险者或同一研究者对农杆菌感染的不同发育阶段的敏感性是不同的,而活性细胞分裂最敏感的部位,如嫩叶、胚胎、头和分泌物是农杆菌。带有叶梗的子叶是白菜基因转化的好受体,而下胚轴是番茄基因转化的好受体。作为一个转基因模型工厂,将叶片转化为农杆菌是最常用的方法。嫩叶细胞的存活率比老叶细胞高,这不仅提高了转换效率,而且使抗药性幼苗健康生长。在实验中,这些叶子在树的上部生长得很好,主要被选为探险树。这些叶子太小了,而且很软,对农业细菌的抵抗力很差,而且很容易在感染后产生细菌污染,这对以后的实验没有好处。在培养过程中,主静脉通常使叶子的边缘向上和向外移动,不利于生长,主静脉中的厚壁组织和厚角组织不利于农业细菌的入侵。选择先清除主静脉,然后进行农杆菌感染。在植物基因突变中,筛选压力对改善筛选基因表达的稳定性非常有用。一些研究表明,在转基因蓝藻细胞的原代中,在SPE的不断筛选下,细胞内的外生基因的表达稳定性得到了改善,否则,转基因基因的不活跃就很容易发生。在实验中,选择100毫克/升的过滤压力对未处理的烟草的叶子和颗粒具有致命的影响,大大降低了假阳性的概率,并改善了筛选基因的稳定性。没有压力的基因筛选更有可能导致基因沉默。

  3.2试管苗移栽前后的管理

  移植是一个非常重要的步骤,在临时的基因转换过程中,转基因幼苗在地面上的生存是模式观察的基础。因为转基因植物在组织培养中生活了很长一段时间,最适合生长的烟,有足够的水,提供全面合理的营养,以及无菌的环境,使转基因植物的生长变得脆弱,外部环境略有变化。很容易发育不良,甚至死亡。幼树的形态学显示,系统释放水分、树叶表面的表面层或蜡层,以及开放的气孔水平,不适合在田间生长。因此,培养的幼苗组织必须经过充分的提炼,以适应外部环境,如高温或低温、干燥的空气、粘附的土壤、各种疾病和害虫。另一方面,抗逆转录病毒苗很容易导致大量死亡,这将影响检测结果的准确性。为了确保对C和Ma烟草片的观察和统计改进,转基因作物的生长速度良好,根系生长和根部选择的分生形态都在根系中。幼苗在房间里生长了一个星期,在阴天的下午被种植,以确保转基因种子有足够的生长阶段。当种植的时候,根部的环境已经被清理干净了,太多的叶子被剪掉以减少水分。当树顶的叶子完全变硬和伸展时,这意味着这棵树存活了下来。为了确保数据中转基因作物的数量,我们可以从一开始就种植转基因作物,以防止转基因作物在移植后发育不良或死亡影响后续的观察和统计。

  3.3外源基因的转录水平

  通过外源基因瞬时转化的烟草植物及其后代的转录水平主要依赖于外源基因的综合模式。即使是在同一种基因群中,不同植物、不同外源基因的转录水平也是不同的。外源基因的完整性及复制品数受到了T-DNA随意整合的影响,转基因植物表现型差异及基因稳定性能够很好的反映转录水平的差异。在同一个实验中得到的另一种转基因植物,由于不同的插入部位而有不同的遗传背景,这对它们的表现有很大的影响,因此遗传影响一定不同。在该实验中选择的转基因受体是从同一株菌株的野生烟草中产生的。在活动及环境条件的严格控制下,转基因子孙的表现形式可以有三种不同的表现强度。进行PCR检测时,可以发现过渡置换度高或低,即使没有过渡置换,特定带宽也会增大。如果外源基因整合到细胞质基因组中,就会显示出母系基因。当它们融合到基因中时,它就向我们展示了孟德尔遗传规律。从理论上讲,在转基因烟草生成中,外来基因的表现强度基本相同,所以外来基因的过渡传导强度较高的烟草植物比某些转基因植物的转质要高。在这项实验中,由于时间的原因,我们没有看到过植物的明显变化,但通过PCR检测,某些植物没有特定的基因片段,这是因为在鉴定分裂过程中,选择单性基因、PCR检测的单种植物的数量太少,而且野生烟草是四倍体,所以根据孟德尔遗传规律,不能解释后代分离的时间。

  结论

  本试验通过对野生型烟草进行PMADS3基因中C区和M区干涉片段的的遗传转化,初步验证了干涉效果,也能够得到可以稳定遗传的外源基因瞬时转化的烟草植株;实验通过外植体的培养以及多重转化的方法,初步探索了烟草的多基因转化,并得到了包含两个目的基因的转基因烟草;对实验室原有烟草进行系谱法选育,希望得到稳定遗传且表达良好的烟草。
  检测外源基因的表达最常用的是PCR技术,该方法简捷、灵敏,外源基因一旦整合就能够有PCR响应,而且一次便可检测大量模板。检测基因表达常用RT PCR技术或者Northern Blot Northern Blot检测,但是Northern Blot Northern Blot检测操作繁琐,相比之下RT PCR更灵敏,需要的RNA量及序列信息较少但易出现假阳性。在RT PCR过程中以总RNA作为模板进行RT PCR扩增,但首先要去除基因组DNA以避免总RNA受基因组DNA污染从而造成RT PCR的假阳性结果。研究表明:PCR及RT PCR的双重检测是转基因烟草获得的较简捷且有效的分子生物学检测方法。电泳图中的条带明暗存在一定的差异。

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