大环内酯磷酸转移酶与小分子化合物的分子对接研究

1.前言 1.1 大环内酯类抗生素及其阿奇霉素简介 1.1.1 大环内酯类抗生素概述 大环内酯类抗生素是一类大量的聚酮化合物,其特征在于14-,15-或16-元内酯一个或多个糖部分连接到该环上S1)。自20世纪50年代初以来,大环内酯已被使用治疗上呼吸道,皮肤和软组织

1.前言
1.1 大环内酯类抗生素及其阿奇霉素简介

1.1.1 大环内酯类抗生素概述

       大环内酯类抗生素是一类大量的聚酮化合物,其特征在于14-,15-或16-元内酯一个或多个糖部分连接到该环上S1)。自20世纪50年代初以来,大环内酯已被使用治疗上呼吸道,皮肤和软组织感染,特别是对b-内酰胺抗生素敏感的患者。尽管历史悠久,但大环内酯类药物仍然存在重要的是治疗许多传染病,2009年销售额在美国的48亿美元是第四最大类别的抗生素销售额(哈马德,2010年)。大环内酯类药物通过可逆地结合肽基附近的肽出口隧道转移中心和破坏蛋白质合成(Bulkley等,2010; Dunkle等,2010; Hansen等,2002; Tu et al。,2005)。而抗大肠杆菌抗生素的常见机制是修饰核糖体靶,灭活的通过修饰酶的大环内酯也是牵连的(Roberts,2008)。已经鉴定了大环内酯磷酸转移酶(MPH)在几种人类病原体中,包括细菌肠杆菌属,克雷伯菌属,假单胞菌属和沙雷氏菌属,由于它们的存在,大环内酯耐药性正在增加关注(Phuc Nguyen et al。,2009; Roberts,2008)。
       MPHs可以分为两类,区别在于差异一级序列和底物特异性(Chesneau等,2007)。两种大环内酯磷酸转移酶类型I和II赋予通过磷酸化氨基糖部分的抗性内酯环的C5位置,共享36%序列同一性。发现mph(A)基因,MPH(20)-I的产物在大肠杆菌Tf481A中发现有效失活两种14-元内酯大环内酯如红霉素和15-元内酯大环内酯阿奇霉素(O'Hara et al。,1989)。分离来自mph(B)基因的MPH(20)-II发现大肠杆菌BM2506具有更广泛的底物光谱包括14-,15-和16–内酯大环内酯类以及酮内酯泰利霉素(Kono等人,1992)。MPHs是包含大量激酶的成员真核蛋白激酶(ePKs)和细菌氨基糖苷类磷酸转移酶(APHs),后者赋予它们抗生素如庆大霉素和妥布霉素(Bassenden等等,2016)。大多数激酶家族成员使用ATP作为它们的磷酸供体,但MPH(20)-I是不寻常的,因为它使用三磷酸鸟苷(GTP)(Shakya和Wright,2010; Shugar,1996),而MPH(20)-II显示偏好GTP超过ATP(Kono等人,1992)。 ATP / GTP核苷酸选择性已经在相关图中观察到并在结构上进行了检查其基础被证明是多因素和复杂的仍然不太了解(Shi和Berghuis,2012)。
       这里描述了MPH(20)-I的三维结构和MPH(20)-II在其apo形式和与GTP类似物复合和各种大环内酯类抗生素。这些结构是第一个三维原子结构确定这种酶类,代表两类MPHs。发现MPH(20)-I和MPH(20)-II在结构上是相关的氨基糖苷磷酸转移酶,但具有独特性涉及底物结合的扩展的柔性接头环。一个用磷酰基供体类似物分析酶大环内酯类是广谱的结构基础MPH(20)-I和MPH(20)-II的抗生素抗性谱以及它们不同的底物特异性。最后一个比较的大环内酯与MPH(20)酶与其相互作用的结合与细菌核糖体为发展提供指导的下一代大环内酯抗生素。
 大环内酯磷酸转移酶与小分子化合物的分子对接研究 

1.1.2 阿奇霉素研究概况

         阿奇霉素为半合成的十五元大环内酯类抗生素,广泛的应用于临床的抗菌药物,阿奇霉素又南斯拉夫Pliva公司开发后转让于美国Pfizer公司,1988年3月首次在美国上市,1993年首次在中国注册,95年在国内被批准生产。本品为白色或类白色结晶性粉末,无臭,味苦易溶于甲醇,在水中几乎不溶。
         阿奇霉素作用机制基本与红霉素相同,主要是与细菌核糖体的50S亚单位结合,抑制依赖于RNA的蛋白合成,阿奇霉素口服后迅速吸收,生物利用度为37%。阿奇霉素广泛利用与临床的十五元大环内酯类抗生素,阿奇霉素具有半衰期长血药浓度组织浓度低的特点,因此需要高灵敏度的测定方法。
         国外有关阿奇霉素的研究报道很少,国外有关阿奇霉素的报道主要集中在1990-1993年的会议论文中,当时液相色谱-质谱联用仪的研究应用正处于商品化的初步推广时候,会议中阿奇霉素代谢的研究结果表明,肝胆系统是阿奇霉素排泄的主要途径,给药量的50%以上经肠道排出,而阿奇霉素经肾排泄比较缓慢,阿奇霉素主要是以原型排出体外,去甲基化是它最主要的代谢途径,阿奇霉素已经在临床上广泛应用,而关于其在中国人体内的代谢情况尚无报道因此有必要深入了解阿奇霉素的代谢过程和机理,为大环内酯类抗生素的研究提供参考。

1.2 分子对接简介

       该研究运用SYBYL-X 2.0软件将配体和受体三维结构的活性位点进行对接,用总得分来反映配体与受体的亲和力大小,计算机辅助药物分子设计方法(computer aided drug design,CADD)思想起源于1894年Emil Fischer提出药物作用的“锁钥原理”。认为药物的作用机制就是和体内的某个靶点(大多是蛋白质)作用,就有如钥匙与锁一般,特定的钥匙(药物分子)只与特定的锁(蛋白质)作用,且中间的作用是相当精密的,药物分子的形状若有一点差异可能就会造成活性很大的改变。计算机辅助药物设计方法主要分成两种:一种是从活性小分子化合物出发,通过改造、修饰等方法得到活性更好、毒性更低的新化合物,这种方法称为基于配体的药物设计;另一种是从生物靶标大分子结构出发,寻找、设计能够与它发生相互作用并调节其功能的小分子,称为基于结构的药物设计。基于配体的药物设计方法包括定量构效关系和药效基团法,基于结构的药物设计方法又分为分子对接和全新药物设计方法。
       本实验使用的分子对接研究可以形象的展示小分子化合物与生物大分子的作用方式,是一种探寻小分子的活性构象的有力方法,也可以为化合物的设计提供很好的思路,但前提是寻找到合适的靶蛋白晶体结构。分子对接依据配体与受体作用的“锁钥原理”,模拟小分子配体与受体生物大分子相互作用。配体与受体相互作用是分子识别的过程,主要包括静电作用、氢键作用、疏水作用、范德华力作用等。通过计算,可以预测两者间的结合模式和亲和力,从而进行药物的虚拟筛选。分子对接首先产生一个填充受体分子表面的口袋或凹槽的球集,然后生成一系列假定的结合位点。依据受体表面的这些结合点与配体分子的距离匹配原则,将配体分子投映到受体分子表面,来计算其结合的模式和亲和力,并对计算结果进行打分,评判配体与受体的结合程度。
2.试验方法

2.1数据来源

       蛋白质结构数据库(Protein Data Bank,PDB)是1971年由美国纽约Brookhaven国家实验室创建的主要收集生物大分子如蛋白质、核酸、多糖以及病毒的结构数据库。该数据库为分子生物学、生物化学和生物工程学等学科的研究提供了结构依据。其数据并不是从文献中收集来的而是由发现者通过X射线单晶衍射、核磁共振、电子衍射等实验室手段而直接提供的,这样就大大扩充了该数据库的容量。

2.2大环内酯磷酸转移酶3D数据准备

       通过查找相关文献,从蛋白晶体数据库(www.pdb.org) 中获取诱大环内酯磷酸转移酶(PDB ID:5igz)的蛋白晶体结构。下载保存为5igz.pdb
通过Sybyl/Biopolymer[19-23]模板对蛋白质结构进行预处理,以PDB格式读取大环内酯磷酸转移酶晶体结构,选择对接配体、删除其他配体及全部结晶水、抽提原配体、暴露活性口袋,并蛋白质结构分析:包括氨基酸末端处理、加氢原子、加载Gasteiger-Huckel电荷,质子化、添加Amber7 FF99原子类型、及氨基酸侧链修复等,以选择的原配体为指针搜索受体蛋白的活性位点、生成分子探针,确定对接位点在蛋白质结构中的位置;保存需要的原配体5igz,保存为:5igz_H-L-0.50-0.sfxc。
       执行步骤:打开SYBYL-X 2.0软件→Biopolymer-Structure Preparation Tool对受体蛋白进行前处理→Extract Ligand Substructures-Select Ligands抽提原配体、暴露活性口袋→Remove Substructures对受体蛋白中对活性口袋对接无影响的结构进行处理→Analyze Selected Structure→对受体蛋白氨基酸进行修饰:末端修饰、加氢、电荷、原子类型、侧链修复处理;保存 5igz1mjt_H-L-0.50-0.sfxc完毕。

2.3配体小分子的虚拟筛选、分子对接

       利用SPECS数据库(www.specs.net)精度筛选找出31个化合物的三维数据建成数据库,以及通过查找文献获得的7个小分子化合物结构.
       使用Sybyl/Basic模块进行分子构建、及力场优化,全部导入小分子化合物表单,保存为:sdf格式。将此38个小分子化合物作为配体,使用SYBYL Surflex模板与受体蛋白1MJT的活性位点进行对接,最后从中选出打分最高的前9个化合物进行分析和讨论。

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