微波辅助提取玄参多糖的工艺研究

1.1玄参简介 玄参,是玄参科植物玄参的干燥根,又名重台、正马、玄台、黑参、元参、馥草等,为双子叶植物玄参科植物玄参的干燥根,是我国自古沿用至今的传统中药,且收录于《神农本草经》。玄参性微寒,味甘、苦、咸,归肺、胃、肾经,具有凉血滋阴、泻火解毒的功

  1.1玄参简介
           玄参,是玄参科植物玄参的干燥根,又名重台、正马、玄台、黑参、元参、馥草等,为双子叶植物玄参科植物玄参的干燥根,是我国自古沿用至今的传统中药,且收录于《神农本草经》。玄参性微寒,味甘、苦、咸,归肺、胃、肾经,具有凉血滋阴、泻火解毒的功效,用于热病伤阴、舌绛烦渴、温毒发斑、津伤便秘、骨蒸劳嗽、目赤、咽痛、瘰疬、白喉、痈肿疮毒等症。近年来,虽然国内外学者对其化学成分进行了一定研究,但大多都是从玄参的有效成分–生物碱上入手,而对玄参多糖的研究甚少。
1.2玄参的药理作用
       玄参在临床上常用于清热解毒,其中含有多种化学成分,如环烯醚萜类、苯丙素苷、黄酮、脂肪酸、挥发油等,均是玄参发挥药理作用的物质基础。由于含有环烯醚萜,玄参具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗炎的作用[4];黄酮使其具有改善血液循环、降低胆固醇、降低心脑血管疾病发病率的作用;脂肪酸使其具有改善人体内新陈代谢的作用。由此可见,玄参多糖应当具有十分广阔的发展前景。
  2.1 多糖的定义
       多糖(polysaccharide)是由糖苷键结合的糖链,至少要超过10个的单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物,可用通式(C6H10O5)n表示。由相同的单糖组成的多糖称为同多糖,如淀粉、纤维素和糖原;以不同的单糖组成的多糖称为杂多糖,如阿拉伯胶是由戊糖半乳糖等组成,多糖不是一种纯粹的化学物质,而是聚合程度不同的物质的混合物。多糖类一般不溶于水,无甜味,不能形成结晶,无还原性变旋现象,多糖也是糖苷,所以可以水解,在水解过程中,往往产生一系列的中间产物,最终完全水解得到单糖。
2.2 多糖的来源及分类
      多糖来源于自然界中的各个方面,而植物是多糖类化合物最主要的获得途径。现代科技可从自然界中提取出来多达300多种多糖,按照不同的获得途径,可将多糖类化合物大致分为五种:(1)植物多糖:茶多糖枸杞多糖魔芋甘露聚糖银杏叶多糖等,植物多糖具有明显的机体调节功能和防病作用。(2)藻类多糖:蓝藻多糖、甲藻多糖、硅门藻多糖、绿藻多糖、褐藻多糖、红藻多糖等,藻类多糖具有显著的抗感染、抗肿瘤、抗凝血、抗辐射、清除氧自由基和延缓衰老等作用。(3)真菌类多糖:灵芝多糖、香菇多糖、猴头菇多糖、茯苓多糖、银耳多糖等,真菌类多糖在一定程度上具有抗肿瘤的活性。(4)动物类多糖:主要为存在于各种动物体内的多糖物质,如糖原、甲壳素、酸性粘多糖等,动物类多糖的主要作用为抗凝血活性。(5)细菌类多糖:结冷胶、凝结多糖、半乳葡聚糖等,细菌类多糖可以在人工控制的条件下发挥巨大的经济价值。
2.3 多糖的药理作用和生理机制
       不论是动物、植物还是微生物,多糖类化合物都在其中参与者重要的生理代谢。研究发现,植物多糖是一种非特异性的免疫调节剂,主要是通过影响内皮系统的功能,影响巨噬细胞、淋巴细胞、白细胞的活性,影响cAMP和cGMP含量等而发挥免疫调节作用;此外,还可以提高巨噬细胞吞噬功能,从而对血清溶血素生成有一定的促进作用;植物多糖还能激活淋巴细胞的增殖作用,逆转免疫抑制状态,可以调节肿瘤患者的细胞免疫功能。近期研究表明,中药免疫调节剂在体内的作用不仅只与免疫系统的作用有关,而且与神经内分泌系统的作用也密切相关。
  2.4 玄参多糖的作用
       向小鼠注入一定量的玄参多糖后,使其负重运动。对运动后小鼠体内的血清尿素氮、血乳酸、肝糖原含量进行检测,最终得出结果:使用玄参多糖后的小鼠,最大运动时间更长,小鼠体内血乳酸、血清尿素的含量显著降低。从而得出结论,玄参多糖具有明显的抗疲劳作用。
  3.1 多糖的提取方法
      由于多糖在植物细胞中存在的位置不同,且植物细胞具有牢固的细胞壁,因此在提取之前必须要进行细胞的破碎工作。具体包括机械破碎(研磨法、组织捣碎法、超声波法、压榨法、冻融法)、溶胀和自胀、化学处理和生物酶降解等步骤。因此,植物多糖提取的研究中采用了许多不同的方法,包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶解法、超滤法、超声波强化法、微波法。其中,微波法以其设备简单、提取率高,节省溶剂、节省时间、节能不产生噪音和污染等优点被广泛应用。本实验就选用微波辅助法进行研究。肖晏婴等采用正交试验,考察温度、时间、pH值及料液比等因素对玄参中多糖提取的影响,用苯酚-硫酸比色法测定其含量,最终得到最优工艺路线为:提取时间50min,提取温度50℃ ,提取液pH= 8,料液比1:40。在此提取条件下,提取出的多糖含量最高,为13.83%。赵保堂等在微波辅助提取红芪多糖的实验中,考察时间、温度、功率、料液比四个因素,使用苯酚-硫酸法鉴定产物中多糖含量,通过单因素试验得到最优路线为:时间30min,温度70-85℃,功率300W,功率300W,料液比1:20。后通过正交分析,得到微波辅助提取红芪多糖的最优工艺路线是:提取时间45min,微波作用功率213W,温度80℃,液料比26:1,提取次数为1次,红芪多糖的含量可达(10.11±0.52)%。其使用的具体提取方法为:红芪干燥根粉末-以蒸馏水为溶剂,采用不同液料比-采用不同微波功率、提取温度、提取时间、提取次数在恒温水浴中进行反应-减压浓缩提取液-加入乙醇(终浓度为85%)进行醇沉-无水乙醇、丙酮洗涤沉淀-真空冷冻干燥-得红芪粗多糖。
  3.2 微波辅助提取的原理
       微波辅助提取又称微波提取,有微波和传统的溶剂萃取法相互结合后形成的一种新型萃取方法。由于微波可以显著提高萃取速度,故该萃取方法被广泛使用。它的原理是在微波场中,各种物质吸取微波能力的差异使得物质中某些区域或萃取体系中的一些组分被选择性加热,从而使得被萃取的目标物质脱离原本的体系,进入到介电常数较小,微波吸收能力相对较差的萃取溶剂中。
  3.3 微波辅助提取的特点
       微波辅助提取特点具体为以下几个方面:(1)微波能穿透到物料内部,使物料表里同时产生热量,且加热均匀性好,加热迅速。(2)微波加热具有选择性,可通过选择适当的萃取溶剂,来达到更佳的萃取效果。(3)微波加热将热量直接作用于介质分子,使整体同时被加热。(4)由于微波萃取的独特的加热机制,几乎没有其他损耗,热效率极高。(5)控制微波功率即可实现加热步骤的继续和终止,易于控制。(6)整个过程无有毒有害气体排放,不产生粉尘污染,安全环保。相反,传统索氏萃取、搅拌萃取和超声萃取等方法费时、费试剂、效率低,且使用试剂大多有毒有害,易污染环境,危害操作人员的身体健康。所以本实验选用微波辅助提取的方法。魏丕伟等[17]采用超声-微波联合提取技术从枳椇中提取多糖,通过单因素试验和正交试验研究了超声功率、微波功率、提取时间、液料比等条件对提取出枳椇多糖的影响。试验结果表明:提取溶剂是蒸馏水时,枳椇多糖的最佳提取条件是超声功率500w、微波功率300w、提取时间15min、料液比1g:15ml,在此条件下枳椇多糖的得率为67%,对比采用传统的回流水提法,得率大大提高,提取时间更短,初次提取率高。杨文杰等[18]在螺旋藻多糖的水提与微波辅助提取的比较试验中得出结论:微波辅助提取方法与热水提取方法的最大的不同在于提取所需时间和最后提取效率这两方面,采用微波提取方法可使所需时间大大缩短。综上所述,微波提取技术具有设备简单、适用范围广、提取效率高、重现性好、节省时间、节约试剂、污染小等特点,是一种越来越被广泛认同的提取技术。
微波辅助提取玄参多糖的工艺研究
4 粗多糖的提纯
       由于植物细胞中的含量十分复杂,故从植物细胞中提取出的植物多糖中必定混杂着蛋白质、色素、低聚糖等杂质,需要分别除去。目前,提纯多糖有许多方法,常见的有分部沉淀法、季铵盐(CTAB)沉淀法、盐析法、高效液相制备色谱等。多糖往往不是单独存在于植物细胞中,而是与多种其他成分共存。由多糖不容于乙醇的特性,向粗多糖提取液中加入乙醇从而使多糖成分脱离其他成分从提取液中沉淀出来,以达到初步除杂的目的。该方法操作简单、便捷,故本实验采用醇沉的方法进行初步除杂。除蛋白的

方法有:乙醇分级、Sevag法、3%三氯乙酸法和蛋白酶法。从植物多糖中除去蛋白质杂质,需要使用一种可使蛋白质沉淀且对多糖成分不加影响的方法。故本实验采用Sevag法。利用蛋白质在三氯乙烷等有机溶剂中变性的特点,配置适量的Sevag试剂(氯仿:戊醇或正丁醇以4:1或5:1比例混合)与溶剂混合反应,使蛋白质絮状物种种出现在提取液和Sevag试剂交界处,后使用分液漏斗将其除去。齐惠玲等[20]使用Sevag试剂除去白及粗多糖中的蛋白质成分,试验结论证明,震荡时间为30min,离心1min,样品溶液与Sevag试剂体积比为3:1,进行2次。
5 多糖的含量分析
       在当前,多糖含量的测定方法大体分为化学法,色谱法,毛细管电泳法和其他方法。化学法中一些方法由于操作简便,仍被广泛认可而沿用至今。
       化学法分为苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸(DNS)法等。其中苯酚-硫酸法是测定多糖最常用的一种方法。在浓硫酸作用下,多糖被水解成单糖,并脱水生成糠醛衍生物,其与苯酚缩合成有色化合物,然后通过比色法确定多糖成分含量,该方法操作简便、重复性好,显色后稳定性较好,但对有色样品结果易偏高。蒽酮-硫酸法是通过使多糖类在浓硫酸作用下水解、脱水,生成物再与蒽酮结合成有色化合物,后于最大吸收波长处测吸光度。该方法稳定性较差,所使用试剂必须新鲜配制并注意避光。此外,色氨酸含量较高的蛋白质对显色反应有一定的干扰。3,5-二硝基水杨酸(DNS)法是在碱性条件下,3,5-二硝基水杨酸与还原糖加热后被还原生成氨基化合物,呈橘红色,比色测定糖含量。该法可测定还原糖和总糖含量,并通过多糖=总糖-还原糖,可获得多糖含量。该方法为半微量定糖法,简便、快速,适用于大量样品的测定。本课题选用苯酚-硫酸法进行多糖含量的测定。肖晏婴等采用正交试验,考察温度、时间、ph值及料液比等因素对玄参中多糖提取的影响,用苯酚-硫酸比色法测定其含量。其试验中标准曲线回归方程为:A=-0.00344 – 0.0133C,R2=0.9993,由曲线可知,多糖含量在每毫升0.01到0.1mg浓度范围内其线性关系良好。韩艳丽等在微波辅助提取茶树花多糖实验中,以葡萄糖为标准品,绘制标准曲线回归方程为A=0.0076C+0.0034(R2=0.9996),最后在最优工艺路线下,测得茶树花多糖含量为2.61%。魏丕伟等[17]采用超声-微波联合提取技术从枳椇中提取多糖实验中,绘制标准曲线回归方程为:y=27.064x+0.0085,R2=0.999,在最优工艺路线下,测得枳椇多糖含量为8.505mg/g,对比采用回流水提法提取枳椇多糖的文献得出结论:采用微波辅助提取设备提取时间短,初次提取率高,微波辅助提取法提取多糖具有较大的优越性。

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