苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量

1 实验材料和设备 1.1 实验材料 葡萄糖 分析纯 重庆渝北化工厂 浓硫酸 分析纯 重庆川东化工(集团)有限公司 苯酚 分析纯 重庆川东化工(集团)有限公司 乙醇 分析纯 重庆川东化工(集团)有限公司 1.2 实验仪器 FA2104B电子天平 上海越平科学仪器有限 UV-11

1 实验材料和设备

1.1 实验材料
葡萄糖                分析纯        重庆渝北化工厂
浓硫酸                分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
苯酚                  分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
乙醇                  分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
1.2 实验仪器
FA2104B电子天平                     上海越平科学仪器有限
UV-1100型紫外/可见分光光度计         上海美谱达仪器有限公司                    

2 玄参多糖检测方法的确定

2.1 标准曲线的绘制
     总糖含量的测定:本课题采用苯酚-硫酸法[22]对玄参多糖含量进行测定,以葡萄糖为标准品测得标准曲线。
(1)试剂的配置
       配置目标葡萄糖标准液浓度:0.1mg/ml。用天平称取葡萄糖标准品10mg置于100mL容量瓶中,加蒸馏水溶解稀释至刻度线,配成的溶液浓度为0.1mg/ml的葡萄糖标准溶液。
(2)原理:多糖类物质在强酸性条件下发生脱水反应生成糖醛或其衍生物.然后再与酚类或胺类化合物缩合,生成有色物质(橙黄色化合物),且颜色长时间不消失,较为稳定,在波长490nm 处有最大吸收[18],所测得的吸光度(A)与多糖的浓度呈线性关系,如图2.1。
(3)操作步骤:取7支试管,分别移取该标准溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL置于试管中,然后分别以蒸馏水补充到2.0mL刻度线。加入6%苯酚1.0mL及浓硫酸5.0mL并混匀,静止10min,然后放置20min,用紫外/可见分光光度计于490nm测定吸光度(A)值。以2.0mL蒸馏水按同样显色操作作为空白对照组。
(4)供试品溶液制备与含量的测定:称取提取出来的玄参多糖2mg,加水至100ml使其溶解,取2ml所得溶液加入6%苯酚1.0 mL及浓硫酸5.0mL,静止10min,摇匀,然后放置20min,用紫外/可见分光光度计于490nm测定吸光度(A)值,以标准曲线即可计算样品中多糖含量。
    

苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量


图2.1 葡萄糖与苯酚-硫酸试剂混合后生成橙黄色化合物
  2.2标准线性回归方程   
8种不同浓度的标准葡萄糖溶液2.2.1测定吸光度(A)值,得到如下表格2.1。据此建立线性回归曲线如图2.2所示。
 

实验编号 1 2 3 4 5 6 7 8
葡萄糖含量(mg/ml) 0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07
吸光度A 0.00 0.064 0.232 0.283 0.391 0.534 0.622 0.753
 

表2.1 标准线性回归方程实验结果
 

3 实验过程

 
3.1实验材料和设备
  3.1.1 实验材料和药品
    正丁醇                分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
    氯仿                  分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
    丙酮                  分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
    盐酸                  分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
氢氧化钙              分析纯        重庆川东化工(集团)有限公司
玄参                                购自重庆市中药材市场
  3.1.2 实验仪器
FA2104B电子天平                       上海越平科学仪器有限
X101型微波催化合成/萃取仪             北京详鹄科技有限公司
UV-1100型紫外可见分光光度计           上海美谱达仪器有限公司
DZF-6020真空干燥箱                    上海齐欣科学仪器有限公司
80-2型医用低速离心机                   江苏正基仪器有限公司
SHZ-95B循环水真空泵                   巩义市予华仪器有限责任公司
    RE-2000A旋转蒸发器                     上海亚荣生化仪器厂
3.2 玄参多糖的提取工艺
  3.2.1 玄参多糖的提取总工艺路线
    玄参多糖提取的总工艺路线如下:
玄参粉→加入溶剂(不同料液比,pH恒定为8)→微波提取(不同微波照射时间,微波提取温度恒定为50℃)→抽滤提取液→浓缩(旋转蒸发至原三分之一体积)→加入Sevag试剂脱蛋白质→加入95%乙醇沉淀→4℃过夜静置→离心→乙醇丙酮洗涤沉淀→干燥→玄参多糖

  3.2.2 玄参多糖提取过程
    (一)预处理:取玄参片500g,洗净、干燥后,与粉碎机中打碎,后用40目筛过筛,得试验原料干燥玄参粉末如图3.1。
苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量
图3.1 玄参干燥粉末
    (二)精确称取5.00g玄参干燥粉末,以试验设定的料液比(pH=8)于三口烧瓶中,(pH以饱和石灰水和盐酸进行调节)如图3.2。
 苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量

图3.2 配制不同的浸提试液 
    (三)微波提取:以试验设定的微波提取时间,微波提取功率进行提取,微波提取温度均为50℃如图3.3。微波萃取机器如图3.4所示。
苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量
图3.3 微波提取过程
苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量
图3.4 微波萃取机器
    (四)抽滤:将提取液进行抽滤,收集滤液(如图3.4)。
 
苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量
图3.5 抽滤
    (五)浓缩:用旋转蒸发器将提取液浓缩到原体积的三分之一(如图3.6)。
  苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量 

图3.6 浓缩
    (六)除蛋白:采用Sevag法,向提取液中加入1/5倍体积的Sevag试剂(氯仿:正丁醇以4:1比例混合),置于分液漏斗中,用力振荡,混合20min,可见提取液与Sevag试剂中层出现白色絮状沉淀,即为蛋白质,取上清,重复此步骤2—3次(如图3.7)。
苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量
图3.7 Sevag法除蛋白
 
 
 
 
 
(七)醇沉:向脱蛋白后的提取液中加入约4倍体积量的95%乙醇,使乙醇浓度达80%,置于4℃冰箱过夜(如图3.8)。
苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量
图3.8 醇沉
 
    (八)离心洗涤干燥:将静置后的提取液以3000r/min的速度离心10min,除去上清液得多糖沉淀(如图3.9),用无水乙醇洗涤多糖沉淀,干燥即得玄参多糖。
苯酚-硫酸法检测玄参多糖含量
图3.9 离心
 
 
 
3.3微波辅助提取玄参多糖单因素试验
  3.3.1单因素变量
    ①微波提取时间:
       精确称取玄参粉5.00g,微波辐射时间分别为2min、4min、6min和8min,微波功率统一为700W,料液比统一为1:30(g/mL),微波提取温度统一为50℃,pH值恒定为8进行微波提取多糖,提取完毕后抽滤,将提取液浓缩到原体积的1/3,浓缩液用Sevag法脱蛋白,然后加入4倍体积量的95%乙醇,使乙醇浓度达80%,置于4℃冰箱过夜,将静置后的玄参提取液以3000r/min速度离心10min,除去上清液得到玄参多糖沉淀,最后用用无水乙醇洗涤玄参多糖沉淀,干燥得到玄参多糖。
②微波功率:
       精确称取玄参粉5.0g,设定微波功率分别为300W、500W、700W和900W,微波辐射时间统一为6min,微波提取温度统一为50℃,料液比为统一1:30(g/mL),pH值恒定为8进行微波提取玄参多糖,提取完毕后抽滤,将提取液浓缩到原体积1/3,浓缩液用Sevag法脱蛋白,然后加入4倍体积量的95%乙醇,使乙醇浓度达80%,置于4℃冰箱过夜,然后将静置后的玄参提取液以3000r/min速度离心10min,除去上清液得到玄参多糖沉淀,最后用无水乙醇洗涤玄参多糖沉淀,干燥得到玄参多糖。
③料液比:
       精确称取玄参粉5.0g,分别以1:10、1:20、1:30和1:40(g/mL)的料液比与水混合,微波功率统一为700W,微波辐射时间统一为6min,微波提取温度统一为50℃,pH值恒定为8进行微波提取多糖,提取完毕后抽滤,将提取液浓缩到原体积的1/3,浓缩液用Sevag法脱蛋白,然后加入4倍体积量的95%乙醇,使乙醇浓度达80%,置于4℃冰箱过夜,将静置后的玄参提取液以3000r/min速度离心10min,除去上清液得到玄参多糖沉淀,最后用用无水乙醇洗涤玄参多糖沉淀,干燥得到玄参多糖。
  3.3.2 试验结果
    ① 微波提取时间对多糖含量影响
    设定微波提取时间分别为2min、4min、6min和8min,微波功率统一为500W,料液比统一为1:30(g/mL),微波提取温度统一为50℃,pH值恒定为8。在此条件下进行单因素试验,结果如表3.1。
   

序号 1   2 3 4
微波提取时间(min) 2 4 6 8
多糖含量
(%)
11.54 13.94 20.27 17.66
 

表3.1 微波提取时间对多糖含量影响
 
    ②微波功率对多糖含量影响
    设定微波提取功率分别为300W、500W、700W和900W,微波辐射时间统一为6min,微波提取温度统一为50℃,料液比为统一1:30(g/mL),pH值恒定为8进行微波提取玄参多糖,在在此条件下进行单因素试验,结果如表3.2和图3.11。
 

序号 1   2 3 4
微波功率
(w)
300 500 700 900
多糖含量
(%)
19.54 21.88 17.27 16.66
 

表3.2微波功率对多糖含量影响
 
    ③料液比对多糖含量影响
设定料液比分别为1:10、1:20、1:30和1:40(g/mL)微波功率统一为500W,微波辐射时间统一为6min,微波提取温度统一为50℃,pH值恒定为8进行微波提取多糖,在在此条件下进行单因素试验,结果如表3.3和图3.12。

序号 1   2 3 4
料液比
(g/mL)
1:10 1:20 1:30 1:40
多糖含量
(%)
14.62 17.53 18.36 20.01
 

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