水稻H2O2信号途径对褐飞虱生长发育材料与方法

1 试验材料 1.1 供试水稻 所用水稻为野生型秀水11。在温控培养箱内催芽后长至5-10cm,用水培液培养法单株播种于塑料框(45cm30cm15cm),于温室(282℃;湿度70~80%;光照12h)培养20-30天后(每一周换一次水培液),移种至塑料杯进行营养土培养(直径8cm高1

1 试验材料

    1.1  供试水稻
       所用水稻为野生型秀水11。在温控培养箱内催芽后长至5-10cm,用水培液培养法单株播种于塑料框(45cm×30cm×15cm),于温室(28±2℃;湿度70~80%;光照12h)培养20-30天后(每一周换一次水培液),移种至塑料杯进行营养土培养(直径8cm×高10cm,单株种植),培养1周于温室使水稻顺应环境后进行后续的实验。
    1.2  供试昆虫
       褐飞虱采自浙江大学华家池校区实验农场,以催芽7d后的TN1水稻幼苗在人工气候室内进行饲养及种群繁殖。
    1.3  施加抑制剂
    对秀水11施加10µM H2O2抑制剂DPI并在对照组(CK)的水培液里面加同样体积的DMSO(二甲基亚砜)。
  1.4  其它材料
       有空调的室内、打孔的玻璃罩子、杯子、试管、海绵、剪刀等。

    2实验方法

2.1 初孵若虫准备
       将水稻苗放入玻璃瓶中,接入7、8头大肚子的雌性褐飞虱,重复20个。将20个玻璃瓶放于室内,直到第一个卵的孵化。孵化的第一天可将少数先出来的出孵若虫用吹气泵将其吹掉。
2.2 接虫处理
       当某天出孵若虫比较多的时候接入水稻苗。水稻苗品种是秀水11,养在50ml离心管中,用水培液培养至4-5叶。每杯水稻苗的基部被罩上带小孔的玻璃罩,以免接入的褐飞虱逃走,将养殖水稻的水培液中加入10µM H2O2抑制剂DPI,对照组(CK)的水培液里面加同样体积的DMSO(二甲基亚砜)。每个玻璃罩中接入15头初孵若虫。
2.3 褐飞虱羽化率与若虫发育历期的测定
       记好第一次接入若虫的时间,每隔12个小时观察记录若虫的数量以及羽化的情况。记录下对照组(CK)和10µM H2O2抑制剂DPI下羽化的褐飞虱的的羽化率及所有羽化成成虫的若虫生长发育历期。整个操作在人工气候室(28±2℃;湿度 67~77%;光照12h)内进行。
2.4 褐飞虱成虫体重的测定
       使用AL204型电子秤(精度为万分之一克)对每一头初羽化的成虫进行称重。将PCR管置于电子称上称重,去皮,再将一头初羽化的成虫放入PCR管,称重读数,记录整个数据分析。整个试验在温度为22±1 ℃的情况下进行。
 

3 结果与分析

    3.1 抑制植物内源H2O2对褐飞虱若虫生长历期的影响

图6  抑制植物内源H2O2对褐飞虱初羽化成虫体重的影响注:柱形图代表平均数±标准误。       实验结果表明,加入10µM H2O2抑制剂DPI褐飞虱若虫的平均历期要显著长于对照组上的褐飞虱若虫,如图1所示,CK、处理组若虫的平均历期分别是14.44天、14.72天;如图2所示,CK、处理组的雌虫平均历期分别是14.74天、15.1天,与对照有显著差异;处理组雄虫平均历期与对照组没有明显差异,CK、处理组的雄虫平均历期分别是14.03天、14.32天。因此施加H2O2抑制剂对褐飞虱若虫有延长生长发育历期的作用。
水稻H2O2信号途径对褐飞虱生长发育材料与方法
                    图1 抑制植物内源H2O2对褐飞虱若虫生长历期的影响
注:柱形图代表平均数±标准误。图中“*”代表处理组与CK比较具有显著性差异(*,p<0.05,Student’s t-tests)
 
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图2  抑制植物内源H2O2对褐飞虱雌(左)、雄(右)若虫生长历期的影响
注:柱形图代表平均数±标准误。图中“*”代表处理组与CK比较具有显著性差异(*,p<0.05,Student’s t-tests)
    3.2 抑制植物内源H2O2对褐飞虱若虫羽化率的影响
         实验结果表明,加入10µM H2O2抑制剂DPI对褐飞虱若虫的羽化率要显著高于对照组上的褐飞虱若虫羽化率。如图 3所示,处理组的若虫羽化率与对照有极显著差异,CK、处理组的羽化率分别是45.33%和62%。结论,抑制植物内源H2O2后植物的抗虫能力有所下降,褐飞虱若虫的羽化率有显著提高。
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 图3  抑制植物内源H2O2对褐飞虱若虫生羽化率的影响
注:柱形图代表平均数±标准误。图中“*”代表处理组与CK比较具有显著性差异(*,p<0.05;**,p<0.01,Student’s t-tests)
    3.3 抑制植物内源H2O2对褐飞虱若虫存活数的影响
        实验结果表明,加入10µM H2O2抑制剂DPI对褐飞虱若虫的存活数要显著高于对照组上的褐飞虱若虫存活数。如图4所示,7月11日、12日、16日、18日处理组的若虫存活数与对照有显著差异,CK、处理组的存活数分别是12只、11.67只、11只、10.67只和13.67只、13.17只、13只、12.67只。7月10日处理组的若虫存活数与对照有极显著差异,CK、处理组的存活数分别是12.67只、14只。其余剩下时间的处理组的存活数与对照组CK并无明显差异。结论,抑制植物内源H2O2后植物的抗虫能力有所下降,褐飞虱若虫在植株上的存活数升高。
水稻H2O2信号途径对褐飞虱生长发育材料与方法
图4  抑制植物内源H2O2对褐飞虱若虫存活数的影响
注:柱形图代表平均数±标准误。图中“*”代表处理组与CK比较具有显著性差异(*,p<0.05;**,p<0.01,Student’s t-tests)
 
    3.4 抑制植物内源H2O2对褐飞虱雌虫产卵量的影响
    实验结果表明,加入10µM H2O2抑制剂DPI对褐飞虱雌虫的产卵量要显著高于对照组上的褐飞虱雌虫的产卵量。如图5所示,处理组褐飞虱雌虫产卵量与对照有显著差异,CK、处理组的产卵量分别是199.08个和303.67个。结论,抑制植物内源H2O2能促使褐飞虱雌虫产卵量的增多。
水稻H2O2信号途径对褐飞虱生长发育材料与方法
图5  抑制植物内源H2O2对褐飞虱雌虫产卵量的影响
注:柱形图代表平均数±标准误。图中“*”代表处理组与CK比较具有显著性差异(*,p<0.05,Student’s t-tests)
    3.5 抑制植物内源H2O2对褐飞虱初羽化成虫体重的影响
    实验结果表明,加入10µM H2O2抑制剂DPI褐飞虱羽化成虫体重与对照组上的褐飞虱羽化成虫体重并无明显差异。如图6所示,CK、处理组的雄虫体重分别是1.29 mg和1.32mg;CK、处理组的雌虫体重分别是2.1 mg和2.18mg。
 
4 讨论
         H2O2信号途径作为植物体内重要的信号分子,可以增强植物抗病性,在防御反应中起到了级联植物体内其他信号途径的作用,并且H2O2在植物应对植食性昆虫的反应中发挥了重要作用。
         H2O2参与调控植物的生长发育,提高植株适应环境胁迫能力,在植物细胞程序性死亡过程中发挥着调节作用。本实验利用加入H2O2抑制剂DPI来比较水稻中H2O2信号途径被抑制后对褐飞虱生长发育的影响来研究H2O2在水稻中,抗虫中起到的重要作用。
        秀水11水稻中H2O2信号途径被抑制后,由于植物内源H2O2含量降低,植株表现出的抗虫能力下降,相比于正常植株来说,其表现在以下几个方面:a.褐飞虱的生长发育历期有延长。b.褐飞虱若虫存活数量升高。c.褐飞虱雌虫产卵量有显著增加。
        水稻H2O2信号途径被抑制后褐飞虱的生长发育历期、若虫存活数量和雌虫产卵量都有显著增加。则说明H2O2信号途径在诱导植物直接抗虫反应中发挥着重要作用。
本实验通过在水稻品系秀水11中添加H2O2抑制剂DPI来探究植物内源H2O2对褐飞虱生长发育以及产卵的影响,为植物H2O2信号途径对褐飞虱的抗性反应研究做基础铺垫。实验结果表明,当植物内源H2O2产生被抑制后,植株表现出对褐飞虱的抗性减弱,证明H2O2在植物防御昆虫为害中起到重要作用。
        此次实验虽然证明了H2O2信号途径对褐飞虱是有抗性作用的,但是关于该信号途径在植物体中具体怎么影响抗虫信号分子的合成以及该信号途径的定位都需要进一步的研究,希望我们所研究的H2O2信号途径对褐飞虱生长发育影响的初探能够为将来水稻飞虱防治研究打下一个良好的基础,以待今后更全面的研究分析。

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